معرفی روش الکتروکِمی لومینسانس(ECLIA)
اساس روش الکتروکِمی لومینسانس(ECLIA)
روشهای سنجش مولکول‌ها در علوم زیستی یکی از مهم‌ترین شاخه‌های تحقیقاتی به شمار می‌آید. گاه نقاط عطفی در این میان پدید می‌آید و روش جدیدی مطرح می‌شود و تا رسیدن به نقطه عطف دیگر و روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلی ادامه می‌یابد. بدیهی است که هر روش محاسن و معایب خاص خود را داشته و با توجه به این ویژگی‌ها، گسترش یافته و یا محدود می‌شود. گاهی روشهای جدید الزاماً جایگزین روشهای قبلی نیستند، بلکه به موازات آنها از محدودیت‌های موجود می‌کاهند.
در ابتدای نیمه دوم قرن بیستم، محصول سیستم ایمنی همورال یعنی آنتی بادی‌ها یکی از نقاط عطف مورد بحث را به وجود آوردند. آنتی بادی‌ها با اتصال اختصاصی به مولکولی که بر ضد آن تهیه شده‌اند، به عنوان ابزاری برای سنجش‌های اختصاصی و سریع در اختیار محققان قرار گرفتند. روش‌هایی که از آنتی بادی‌ها به عنوان شناساگر بهره می‌گیرند، روشهای سنجش ایمنی (Immunoassay) نام دارند.
یکی از انواع طبقه‌بندی سنجش‌های ایمنی بر اساس نوع ماده نشاندار بنا شده است. به عنوان مثال Radioimmunoassay، Enzyme immunoassay، Immunofluorescence و ... که در این میان روش سنجش ایمنی رادیواکتیو دارای قدمت بیشتری نسبت به سایر روش‌ها می‌باشد.
در روش سنجش ایمنی رادیواکتیو هرکدام از جزء آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی را می‌توان با ماده رادیواکتیو نشاندار کرد. استفاده از ماده رادیواکتیو به عنوان نشانگر باعث ایجاد معایبی از جمله خطر تشعشع و نیمه عمر کوتاه کیت‌ها شده است.
روش سنجش ایمنی که بعد از روش رادیواکتیو ابداع گردیده روش سنجش های ایمنی آنزیمی (ELA) است که مانند روش قبل اساس آنها بر واکنش آنتی ژن – آنتی بادی می‌باشد، با این تفاوت که جهت ردیابی واکنش مذکور به جای عناصر رادیواکتیو از آنزیم و واکنش آنزیمی استفاده می‌شود.
تکنولوژی که در سال‌های اخیر طراحی شده است به نام کمی لومینسانس (CL) یا لومینسانس (L) معروف است که محصول نهایی قابل سنجش آن نور می‌باشد. کمی لومینسانس به تابش نور از محصول تهییج شده یک واکنش شیمیایی، زمانی که به سطح پایه بر می‌گردد، اطلاق می‌شود. مثال بسیار ساده برای این واکنش آتش گرفتن یک چوب کبریت می‌باشد. در این فرآیند گوگرد در طی یک واکنش شیمیایی، اکسید شده و تولید نور می‌کند. با تلفیق یک واکنش کمی لومینسانس و یک واکش ایمونولوژیک می‌توان با اندازه‌گیری مقدار نور تابش یافته، غلظت مولکول‌ها را تعیین کرد.
شکل (1) : شعله چوب کبریت که بیان کننده یک واکنش کمی لومینسانس می‌باشد
اصول پایه و تعریف کِمی‌لومینسانس
وقتی یک الکترون از سطح تهییج شده یا بالاتر به سطح پایین‌تر انرژی می‌رسد و انرژی خود را به صورت نور متصاعد می‌کند، واکنش را به نام لومینسانس می‌شناسیم. انواع متعددی از پدیده لومینسانس شناخته شده اند که شامل فلورسانس، فسفرسانس، و کمی لومینسانس می‌باشند. پدیده کمی لومینسانس از سایر پدیده های لومینسانس متفاوت است و در آن واکنش شیمیایی یا الکتروشیمیایی (و نه پدیده فوتولومینسانس) باعث تهییج نمی‌شود ولی حاصل این تهییج مشابه فلورسنس بوده و در حین بازگشت الکترون به سطح پایه انرژی، نور منتشر می‌شود.
الکتروکِمی‌لومینسانس نوعی از کِمی‌لومینسانس است که در آن واکنشی که به تولید نور می انجامد با جریان الکتریکی آغاز و با قطع آن خاتمه می یابد و نور تولید شده در این روش تنها در محل الکترود ایجادکننده جریان الکتریکی به وجود می آید. کنترل زمان تابش نور، مشکل تداخل بیش از حد نور تابش شده از نمونه های مجاور را رفع می کند و همچنین کنترل محل تابش نور (تنها در سطح الکترود) باعث می شود تا بتوان تمامی نور تولید شده از نمونه را در محلی بسیار نزدیک به دستگاه دتکتور متمرکز کرد. این موضوع، با افزایش نسبت سیگنال به نویز (نور زمینه) دقت را بالا برده و همچنین با تمرکز نور بر سطح دتکتور، حساسیت را تا حد بسیار زیادی افزایش می دهد. در حال حاضر، سایر روشهای ایمونواسی فاقد چنین حساسیتی می باشند. همچنین با کنترل محل تابش نور می توان نور تابش یافته از بیش از یک واکنش ایمونولوژیک در یک نمونه را همزمان در محل های مختلف قابل اندازه گیری کرد و بدین ترتیب می توان غلظت چند ماده را در نمونه به صورت همزمان تعیین کرد. از مزایای دیگر این روش امکان انجام آزمایش در زمانی بسیار کوتاه است.
اصول روش الکتروکمی لومینسانس (ECL)
الکتروکمی لومینسانس فرآیندی است که با واسطه مولکول های متعددی از جمله ترکیبات روتنیم1، اسمیم2، رنیم3 و یا دیگر عناصر شناخته شده رخ می دهد. فرایند الکتروکمی لومینسانس باعث تولید پیش سازهای پایدار در سطح الکترود می شود که محصول نهایی این واکنش تولید نور است.
در مثالی که در این مقاله توضیح داده می شود ترکیبی به نام روتنیوم تریس بای پیریدیل «Ru(bpy)3 12+» به همراه ماده تریپروپیلامین (TPA) استفاده می شود. در روش های آزمایشگاهی، از استر آن – هیدروکسی سوکسینیمید (NHS) روتنیوم استفاده می شود؛ چرا که راحت تر به پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و هاپتن ها متصل می شود (طیف وسیعی از آنالیت ها را در بر می گیرد).
پایه و اساس ECL در استفاده از کمپلکس روتنیوم تریس 4 و تریپروپیلامین (TPA) می باشد که محصول نهایی به صورت نور قابل اندازه گیری است. آغاز واکنش توسط جریان الکتریکی بوده که در پایان منجر به تولید نور از کمپلکس روتنیوم تریس خواهد شد. در این مرحله ولتاژی الکتریکی به کمپلکس ایمنولوژیک روتنیوم تریس اعمال می شود که این کمپلکس به استرپتوآویدین پوشیده شده در سطح میکروپارتیکل ها متصل شده است. استفاده از واکنش الکتریکی از مزایای این روش می باشد که می توان دقیقاً کل واکنش را تحت کنترل قرار داد.
مزایای استفاده از ECL
الکترو کمی لومینسانس تکنولوژی جدیدی است که دارای مزایای نسبت به تکنیک های تشخیصی دیگر می باشد. از جمله این مزایا می توان موارد ذیل را ذکر نمود.
- عدم دخالت اپراتور در روند انجام تست ها و درنتیجه کاهش میزان خطای تکنیکی (سیستم close)
- دارای معرف غیر ایزوتوپی بسیار پایدار و با کاربرد آسان
- حساسیت بالا جهت اندازه گیری آنالیت ها با مقادیر بسیار کم و همچنین در مدت زمان کوتاه
- سنجش با کیفیت بالا
- برگشت سریع و آماده شدن برای سنجش دیگر
- قابلیت تشخیص همه آنالیت ها با استفاده از این تکنیک و در یک نوع فاز جامد (عدم استفاده از چاهک مخصوصی برای هر تست)
- دارای قدرت تکرار پذیری بسیار بالا و کاهش مصرف معرف ها و در نتیجه کاهش هزینه ها و کاهش زمان
محدودیت های استفاده از ECL
همانطور که قبلاً اشاره شد هر روشی علاوه بر مزایا دارای معایب و محدودیت هایی نیز می باشد که این محدودیت ها شامل :
- بسته بودن سیستم ( در این روش بایستی حتماً از دستگاه و کیت ها و محلول ها و همچنین سر سمپلر و چاهک های مخصوصی استفاده شود که کاملاً انحصاری و در اختیار یک شرکت مشخص می باشد)
- هزینه قابل توجه دستگاه، کیت ها و محلول های آن
روش انجام تست در ECL
چهار روش در سیستم الکتروکمی لومینسانس وجود دارد (شکل 2) :
- روش رقابتی جهت اندازه گیری آنالیت های کوچک
- روش ساندویچ (یک مرحله ای و دو مرحله ای) جهت اندازه گیری آنالیت های بزرگ
- روش پل زدن (Bridging) برای تشخیص آنتی بادی ها
- روش سنجش پروب های نوکلوئیک اسید
روش ساندویچی
روش ساندویچ برای اندازه گیری آنالیت ها پروتئینی مانند هورمون TSH بکار می رود.
- در مرحله اول نمونه با آنتی بادی بیوتینه TSH و آنتی بادی اختصاصی TSH که با روتنیوم نشاندار شده است مخلوط می گردد. در زمان انکوباسیون اول آنتی بادی اختصاصی با TSH موجود در نمونه اتصال پیدا می کند.
- در مرحله دوم استرپتوآویدین متصل به میکروپارتیکل ها اضافه می شود. در انکوباسیون دوم آنتی بادی بیوتینه به استرپتوآویدین که در سطح میکروپارتیکل ها پوشیده شده متصل می گردد.
- پس از انکوباسیون دوم مخلوط واکنش شامل کمپلکس ایمنی به سلول اندازه گیری دستگاه ECL منتقل می شود. کمپلکس ایمنی بر روی الکترود مغناطیسی قرار گرفته و نمونه ها و معرف های اضافی توسط محلول شستشو خارج می گردند. سپس واکنش الکتروکمی لومینسانس که باعث ایجاد نور می شود در سطح الکترود مغناطیسی انجام می پذیرد.
- در این مرحله میزان نور تولید شده با غلظت TSH موجود در نمونه رابطه مستقیم دارد. ارزیابی و محاسبه غلظت مولکول با استفاده از منحنی کالیبراسیون که آن نیز به واسطه غلظت استانداردها رسم شده است توسط دستگاه به صورت خودکار انجام می گردد.
روش پل زدن (Bridging)
در این روش از دو نوع آنتی ژن کنژوگه شده (کنژوگه با بیوتین و کنژوگه با روتنیوم) استفاده می شود. این روش شبیه به روش ساندویچ بوده با این تفاوت که در این روش آنتی بادی مورد سنجش می باشد (مانند IgG – IgM و IgA)
- در اولین گام، آنتی بادی مورد هدف در سرم به آنتی ژن نشاندار متصل شده و کمپلکس ایمنی تشکیل می دهند.
- در مرحله دوم این کمپلکس ایمنی به استرپتوآویدین پوشیده شده در سطح میکروپلیت ها متصل می شود.
- پس از انکوباسیون دوم مخلوط واکنش شامل کمپلکس ایمنی به سلول اندازه گیری دستگاه ECL منتقل می شود. کمپلکس ایمنی بر روی الکترود مغناطیسی متصل شده و نمونه ها و معرف های اضافی توسط محلول شستشو خارج می گردند. سپس واکنش ECL در سطح الکترود که باعث ایجاد نور می شود صورت می پذیرد.
در این مرحله میزان نور تولید شده با مقدار مولکول موجود در نمونه رابطه مستقیم دارد. در روشECL ارزیابی و محاسبه غلظت مولکول از طریق منحنی کالیبراسیون انجام شده که آن نیز به واسطه غلظت استانداردها رسم شده است.
نتیجه گیری
روش الکتروکمی لومینسانس را با توجه به مزایایی که قبلاً ذکر شده از جمله دقت، صحت، قابلیت سنجش چند مولکول متفاوت به طور همزمان در نمونه مورد آزمایش، جوابدهی سریع حتی برای تست های فوق تخصصی و عدم اتلاف وقت و در نتیجه رضایت مندی هرچه بیشتر بیماران و پزشکان محترم که هدف تمامی همکاران می باشد را می توان به عنوان روشی که نسبت به سایر روش ها ارجحیت دارد در نظر گرفت. با این روش کمی لومینسانس نیز یک روش نوین در سنجش مولکول ها می باشد ولی به دلایلی که در این مقاله جایگاه مطرح نمودن این بحث نمی باشد جایگاه خود را سریعاً به الکتروکمی لومینسانس تغییر داده است و چنانچه آزمایشگاهی شرایط انجام تست به روش الکتروکمی را داشته و همچنین کیفیت در پاسخ دهی به بیماران را در سرلوحه عملکرد خود قرار داده باشد مطمئناً این روش را به سایر روش ها ترجیح خواهد داد.
REFRENCES
- 1- Imai, A. Nishitani, H. Akimoto, Y. Tsukamoto, J. Biolumin. Chemilumin. 4 (1989) 500-504.
- 2- Kobayashi, K.Imai, Anal. Chem. 52 (1980) 424- 427.
- 3- H., 1996b.Enhancing immune-electrochemiluminescense (IECL) for sensitive bacterial detection. J. Immunol. Metods 192 (1-2), 63-71.
- 4- H., 1998a. Comparitives studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescence immunoassays. J. Immunol, Methods 218, 1-8.